1570 fasste eine Gruppe Unzufriedener, darunter Hamilton und sein Onkel, Erzbischof John Hamilton, den Plan, sich des ungeliebten Regenten zu entledigen. Als Stewart am 23. Januar 1570 im schottischen Linlithgow am Haus des Erzbischofs vorbeiritt, feuerte James Hamilton aus einem Fenster einen Schuss aus einer Arkebuse ab. Ob er dabei nur politische Motive hatte oder auch persönliche Rache an
dem ihm verhassten Stewart üben wollte, bleibt unklar. Das Pferd neben Stewart brach tödlich getroffen zusammen, er selbst blutete aus einer Bauchwunde. Stunden später starb er an seinen Verletzungen. Erstmals wurde damit ein Attentat mit einer Feuerwaffe verübt.
Während das schottische Parlament die Hamilton-Familie als Aufständische verfolgte, gelang dem Attentäter die waghalsige Flucht bis nach Frankreich, wo er zuletzt 1581 dokumentiert ist.
