Am 25. Februar 1570 veröffentlichte er die Bulle „Regnans in excelsis“, mit der er Königin Elisabeth exkommunizierte, ihre Untertanen von ihrer Gehorsamspflicht entband und jeden mit dem Kirchenbann bedrohte, der sich dem widersetzte. Als Grund gab er an, Elisabeth, „Dienerin der Schändlichkeit und falsche Königin“, verbiete die wahre Religion und umgebe sich mit Häretikern. Sie verfolge Katholiken, habe die katholische Liturgie verboten und falsche Priester eingesetzt. Die wahre Königin von England sei Maria Stuart, Königin von Schottland.
Elisabeth reagierte auf die Bannbulle mit verschärften Repressalien gegen Katholiken und besonders gegen die Jesuiten. Katholische Adlige indes versuchten im sogenannten Ridolfi-Plot 1571 vergebens, Königin Elisabeth zu entführen und durch Maria Stuart zu ersetzen.
