Die Bibliothek hat eine bewegte Vergangenheit: Als ihr Gründer gilt Kurfürst Ottheinrich (1556 –1559), der Bestände aus verschiedenen Bibliotheken zusammenführte. Nach der Eroberung der Kurpfalz durch die katholischen Truppen Tillys im Jahr 1622 beanspruchte Papst Gregor XV. die wertvolle Sammlung; die „Ottheinrich-Bibel“ wurde außerdem nach München verbracht. Erst 1816, durch Bestimmungen des Wiener Kongresses, erhielt Heidelberg einen Teil, nämlich die deutschsprachigen Handschriften, zurück. Alle Drucke und die fremdsprachigen Handschriften aber befinden sich bis heute in Rom.
