Die Reformation stellte einen gravierenden Einschnitt in der Geschichte der Franziskaner dar, der im deutschsprachigen Raum zeitweise sogar ihre Existenz zu gefährden drohte. Die Theologie Martin Luthers stellte das Mönchtum insgesamt in Frage. Es basierte auf der Vorstellung, dass der Verzicht auf Erden die Teilhabe am Reich Gottes sicherte. Dagegen stellte Luther den Lehrsatz, dass nicht gute Werke, sondern allein der Glaube selig mache. Für den Wittenberger Reformator war das Mönchtum reines Menschenwerk, das nicht direkt aus der Heiligen Schrift zu begründen war. Mehr noch: Er sah gerade in den Mendikanten, den Bettelmönchen, Müßiggänger, die auf Kosten der Gesellschaft lebten und durch ihr Almosen-Sammeln den wirklich Armen schadeten.
Der Angriff der Reformation auf die Grundlagen ihrer Lebensweise traf die Franziskaner zudem in einer Zeit, in der ihr Ansehen in vielen Teilen Europas gesunken war. Kritik an den Bettelorden war zumal im deutschsprachigen Raum um 1500 Legion; sie seien Betrüger, so der Standardvorwurf, die heimlich Besitz horteten und ihre Armut nur vorschützten. Diese Art der Kritik war weniger grundsätzlich als die Luthers – denn sie erkannte den Wert der Armut im Prinzip an und rieb sich nur an der mangelnden Umsetzung des Ordensideals. Aber sie schmälerte das Ansehen der Franziskaner und ließ Zweifel daran erkennen, ob das Armutsideal wirklich lebbar war. Und auch der Orden selbst rang – wieder einmal – um den richtigen Weg zur Verwirklichung der franziskanischen Idee der paupertas. Bereits im 13. Jahrhundert war eine Bewegung innerhalb der Franziskaner entstanden, die eine zu starke Aufweichung der Armut kritisierte und eine buchstabengenaue Beachtung („Observanz“) der Regel forderte. Die Auseinandersetzung um die „Observanten“ nahm so scharfe Formen an, dass Papst Leo X. 1517 – im Jahr der Veröffentlichung der Thesen Luthers also – schließlich die Konsequenzen zog und die beiden Richtungen voneinander trennte. So entstanden zwei Orden, die strikten Observanten, die an der Eigentumslosigkeit des Ordens festhielten, und die „Minoriten“ oder „Konventualen“. Für diese galt zwar auch, dass das einzelne Ordensmitglied der Armut verpflichtet sei, wohl aber sollte der Orden oder ein Kloster über Besitz und Einkünfte verfügen können.
Wo sich in Europa die Reformation durchsetzte, da wurden die meisten Franziskanerklöster geschlossen. Dabei zeigte sich, dass die Minoriten schwerere Verluste hinnehmen mussten als die Observanten, vor allem im Heiligen Römischen Reich Deutscher Nation. Hatten hier zu Beginn des 16. Jahrhunderts noch knapp 200 Minoriten- und gut 160 Observantenklöster bestanden, so sahen die Verhältnisse 50 Jahre später ganz anders aus: Von den Häusern der Minoriten waren ganze 65 übriggeblieben, während immerhin noch gut 130 Niederlassungen der Observanten existierten. Die Observanten vermochten sich von diesem Einbruch wieder zu erholen – 1700 verfügten sie mit etwa 260 Klöstern über mehr Häuser als je zuvor. Die Zahl der Minoritenklöster hingegen sollte nur noch geringfügig steigen.
