Die Wende brachte schließlich die Einladung des Vogelkundlers Johann Wilhelm von Müller, ihn auf einer Forschungsreise nach Afrika zu begleiten. Am 31. Mai 1847 brachen Brehm und der Baron auf, erst 1853 kehrten sie zurück. Die Expedition führte durch Ägypten, auf die Sinai-Halbinsel und in den Sudan. Schon in seinem Elternhaus hatte Brehm gelernt, Tiere zu präparieren, und dies gehörte, dem Zeitgeist entsprechend, auch zu seinen Hauptaufgaben während der fünfjährigen Afrika-Reise. Doch zugleich war er ein scharfer Beobachter der Tiere in ihrem natürlichen Lebensumfeld: „Ägypten war damals für mich eine neue Welt, jeder mir noch wenig bekannte Vogel ein köstlicher Fund“. Die Zusammenarbeit mit Müller verlief jedoch nicht reibungslos. Brehm war schon in jungen Jahren wenig diplomatisch und konnte durchaus grob werden, wenn er sich ungerecht behandelt fühlte.
Nach seiner Rückkehr 1853 nahm Brehm das Architektur-Studium nicht mehr auf, sondern begann in Jena Naturwissenschaften zu studieren. Dieses Studium schloß er nur zwei Jahre später mit der Promotion ab – als Dissertation hatte der 27jährige seine „Reiseskizzen aus Nordafrika“ vorgelegt. In den folgenden Jahren verband Brehm seine schriftstellerische und journalistische Tätigkeit mit ausgedehnten Reisen. Diese führten ihn bis an das Nordkap und, als Begleiter des Herzogs von Sachsen-Coburg und Gotha, nach Äthiopien. Dabei stand stets die Beobachtung der Tierwelt im Mittelpunkt. In seinen Zeitschriftenartikeln und Buchveröffentlichungen konnte Brehm daher überwiegend auf eigene Erfahrungen zurückgreifen, doch stand er auch im Austausch mit anderen Tierforschern, die ihm über ihre Arbeit berichteten.
Der Lohn für die breite Anerkennung Brehms als Forscher folgte 1862 mit der Ernennung zum ersten Direktor des Zoologischen Gartens in Hamburg. Dies war durchaus keine reine Verwaltungstätigkeit – Brehm sollte auch als Zoodirektor weiter reisen und vor allem darüber publizieren. So begann er 1863 mit der Arbeit an seinem „Illustrierten Thierleben“. Bis 1869 erschienen insgesamt sechs Bände. Damals stand Brehm bereits nicht mehr dem Hamburger Zoo vor. Von Anfang an hatte es Reibereien zwischen dem rauhbeinigen Forscher und dem Verwaltungsrat gegeben, der Brehm schließlich die Fähigkeit absprach, einen Zoo leiten zu können: Ihm fehle es an der „Fähigkeit der Menschenführung“ und „administrativem Talent“. Tatsächlich fiel es Brehm schwer, mit anderen Menschen zusammenzuarbeiten, andererseits hatten die Mitglieder des Verwaltungsrats oft kein Verständnis für seine neuen Ideen, etwa wenn dieser eine artgerechte Haltung der Tiere forderte. Dies war ihm auch wichtig, als er 1869 die Leitung des Berliner Aquariums übernahm, eine Funktion, die er sechs Jahre lang innehatte.
Im Anschluß nahm Brehm wieder eine ausgedehnte Reisetätigkeit auf. Zwei dieser Reisen unternahm Brehm zusammen mit dem österreichischen Kronprinzen Rudolf. Der Kronprinz hatte den Tierforscher 1873 bei der Weltausstellung in Wien kennengelernt. Rudolf war sehr an der Ornithologie interessiert und hatte daher den Kontakt gesucht. Zwischen dem Forscher und dem Kronprinzen entwickelte sich in der Folge eine enge Freundschaft, sehr zum Mißvergnügen des Wiener Hofs, wo man den Protestanten und Freimaurer Brehm nicht als geeigneten Umgang erachtete. Rudolf ließ sich davon nicht abschrecken und lud den Forscher zu „Adlerjagden nach Südungarn“ ein. „Ich habe bestimmte Nachrichten von vielleicht 20 Adlerhorsten und glaube, daß wir alle werden lernen können, wenn wir sie besuchen und fleißig dabei beobachten.“
