In der Kirche präsentiert das Stadtmuseum Berlin nach der umfassenden Sanierung die neue Dauerausstellung „Vom Stadtgrund bis zur Doppelspitze“, in der anhand vieler Originalobjekte und mit neuen Medien die Geschichte Berlins und der Nikolaikirche in sieben Themeninseln erzählt wird. Auch das umgebende Nikolaiviertel wird mit einbezogen: Ein Planungsmodell aus der Wiederaufbauzeit in den 1980er Jahren und eine Multimediastation laden zu einem selbst gestalteten virtuellen Spaziergang ein. Kamerafahrten führen zu den einzelnen Zeugnissen der Vergangenheit, deren Geschichte in Wort und Bild erläutert wird. Ähnlich ist es mit der frühesten Berliner Stadtgeschichte: Auf dem mittelalterlichen Stadtgrundriss sind wichtige archäologische Funde aus der Frühzeit so platziert, dass sich die einzelnen Fundorte mit nachgewiesenen Bauwerken identifizieren lassen. Der Geschichte dieser Gebäude kann man auf einem interaktiven Bildschirm nachforschen.
Der Besucher begibt sich so auf eine Spurensuche vom 13. bis ins 21. Jahrhundert und entdeckt die religiöse Tradition ebenso wie die Baugeschichte der Nikolaikirche, dem „Pantheon der Berliner“: Vor allem in den Seitenkapellen finden sich zahlreiche Grabdenkmäler, etwa von Philipp Jacob Spener (1635 – 1705), dem Begründer des Pietismus, oder dem Hofhistoriographen Samuel von Pufendorf (1632– 1694).
Ein besonderer Höhepunkt ist die unter dem Hauptportal der Kirche angelegte Beyersche Gruft, eine der prachtvollsten Grabkapellen der Kirche. Erstmals können Museumsbesucher nun auch über steinerne Stufen auf das Bodenniveau der Stadtgründungszeit hinabsteigen und den erst 1990 wiederentdeckten Münzschatz besichtigen, der durch Berliner Bürger zwischen 1514 und 1734 für den Turmknauf der Nikolaikirche zusammengetragen wurde.
