Die große Stunde Mergentheims schlug jedoch erst 1525. In diesem Jahr endete die Geschichte des Deutschen Ordens in Preußen. Der damalige Großmeister Albrecht von Brandenburg-Ansbach bekannte sich zum Luthertum, und der große Reformator höchstpersönlich empfahl die Umwandlung des Ordensstaates in ein weltliches Herzogtum. So geschah es: Albrecht wurde Herzog von Preußen unter polnischer Oberhoheit – und die stolzen Ritter waren plötzlich heimat- und führungslos.
Der Deutschmeister – so der Titel des bislang höchsten Amts des Ordens innerhalb der Grenzen des Heiligen Römischen Reichs, also die Nummer zwei nach dem Hochmeister in Preußen – übernahm die Führung. Er residierte in der Burg Horneck am Neckar. Diese wurde allerdings in den Wirren des Bauernkriegs im Frühjahr 1525 von den Aufständischen zerstört. Mergentheim war danach eigentlich nur zur Überbrückung als Residenz vorgesehen, doch aus dem Provisorium sollte ein Dauerzustand werden.
Die Nachfolger von Deutschmeister Walter von Cronberg (amt. 1527– 1543), der sich vom Kaiser die Zusage gesichert hatte, auch den nun dauerhaft vakanten Posten des Hochmeisters als Administrator übernehmen zu dürfen, begannen umgehend mit dem standesgemäßen Umbau des Schlosses in Mergentheim.
Steht man im Innenhof der Anlage, kann man in der Hauptfassade noch architektonische Relikte der Wasserburg der Grafen von Hohenlohe aus dem 12. Jahrhundert erkennen, die bei einer Restaurierung freigelegt wurden, so etwa zugemauerte gotische Fensterbögen.
Die Ordensritter mochten einen Staat verloren haben, ihren Geltungsdrang schmälerte das aber kaum. So wurde in den folgenden Jahrhunderten in Mergentheim eifrig gebaut. Nach der ersten umfangreichen Erweiterung in der zweiten Hälfte des 16. Jahrhunderts taten sich später die beiden Hochmeister Franz Ludwig von Pfalz-Neuburg (amt. 1694–1732) und Karl Alexander von Lothringen (amt. 1761–1780) als besonders eifrige Baumeister hervor.
Der zweite Stock des Schlosses ist der Geschichte des Deutschen Ordens gewidmet. Beispielsweise zeigt ein fast raumfüllendes Modell der Burg Rehden (im heutigen Radzyn´ Chełmin´ski in Polen), wie die mächtigen Bollwerke der Ritter im Kampf gegen die heidnischen Prußen ausgesehen haben. Einen Schwerpunkt der Ausstellung bildet natürlich die Zeit nach 1525, als Mergentheim die Zentrale des Ordens war.
Seit dem 16. Jahrhundert entwickelte sich der Orden immer mehr zu einer Karriereoption für nachgeborene Adlige, die ihren älteren Brüdern die Titel überlassen mussten. Die Auswahlkriterien wurden dabei mit der Zeit immer elitärer. Musste man zunächst noch vier adlige Vorfahren nachweisen, um Ritter werden zu können, waren es seit 1671 stolze 16.
