Maria Stuart entsprach kaum dem von Knox gezeichneten Bild der religiösen Fanatikerin, die alle rechtgläubigen Protestanten auf den Scheiterhaufen schickte, die sich ihr nicht unterwarfen. Selbst wenn sie es gewollt hätte: Sie besaß nicht die Macht, um in Schottland eine solche Politik zu betreiben. Aber Knox war nun darauf festgelegt, in Maria Stuart eine Götzendienerin, eine tyrannische Herrscherin und eine königliche Hure zu sehen – dies war sein Bild katholischer Königinnen, ganz unabhängig von ihrer realen Politik.
Knox verkörperte wie wenige andere britische Theologen seiner Zeit die Sache des militanten Protestantismus, der keinerlei Kompromisse kannte: weder mit der vorreformatorischen Tradition noch mit einer Obrigkeit, die nicht ganz und gar rechtgläubig war. Knox wurde im Jahr 1514 in der Nähe der schottischen Stadt Haddington geboren. Er stammte aus eher bescheidenen Verhältnissen, doch war seine Familie über Generationen hinweg mit den Earls of Bothwell, einer wichtigen Adelsfamilie, verbunden.
Knox studierte an der Universität St Andrew’s Theologie und Kirchenrecht und wurde Ende der 1530er Jahre zum Priester geweiht. Er wandte sich jedoch wie viele andere Geistliche auch in den Jahren 1543 bis 1545 dem Protestantismus zu. 1547 hielt er seine erste protestantische Predigt in St Andrew’s, in der er den Papst bereits mit dem Untier aus der Offenbarung des Johannes und dem satanischen Widersacher des heiligen Gottes aus dem alttestamentlichen Buch Daniel identifizierte.
Knox vertrat auch später mit großem Nachdruck die Position, daß der Papst der Antichrist, der große endzeitliche Gegenspieler Christi, sei, und ließ sich in der Schärfe seines Antikatholizismus von niemandem überbieten. Seine militante Haltung wurde noch gesteigert durch sein persönliches Schicksal. St Andrew’s wurde 1547 von französischen Truppen eingenommen, die im Dienst der Königinmutter Marie de Guise standen. Knox geriet in Gefangenschaft und wurde zu einer Galeerenstrafe auf einem französischen Kriegsschiff verurteilt, eine Form der Bestrafung, die einer langsamen Hinrichtung gleichkam. Im Februar 1549 wurde er jedoch freigelassen und ging nach Berwick, einer englischen Garnisonsstadt an der Grenze zu Schottland, wo es eine größere Gemeinde von protestantischen Schotten gab. Knox wurde Seelsorger dieser Gemeinde und fand in Berwick Gelegenheit, seine eigene theologische Position zu entwickeln. Dabei sah sich der stark von den Büchern des Alten Testaments geprägte Knox in der Tradition der Propheten des Volkes Israel. Kompromisse mit der vorreformatorischen Tradition galten ihm als Götzendienst, den es auszurotten galt.
Knox fand in diesen Jahren in England ein fruchtbares Betätigungsfeld. Der junge König Eduard VI. und seine Berater wandten sich von den theologischen Kompromissen der Vergangenheit ab und bekannten sich weitaus stärker als Heinrich VIII., dem es nur um die Unabhängigkeit von Rom gegangen war, offen zum Protestantismus. Gleichwohl sah Knox im Rückblick die Kirchenpolitik Eduards VI. noch immer als gefährlich halbherzig an. Er wurde jedoch Ende 1551 zu einem der Hofkapläne des Königs ernannt und hätte wohl auch zum Bischof aufsteigen können, wenn er es denn gewünscht hätte. Die Thronbesteigung Maria Tudors, die eine entschiedene Katholikin war, setzte der Tätigkeit des schottischen Geistlichen in England jedoch ein Ende. Knox ging ins Exil auf den Kontinent, wo er nach Aufenthalten in Frankfurt und Zürich und einer zeitweiligen Rückkehr nach Berwick im Genf Calvins eine neue Heimat fand.
